文章信息
期刊名稱：《Journal of Advanced Research》
文章標(biāo)題：《Development of a novel Cas13a/Cas12a-mediated “one-pot”dual detection assay for genetically modified crops》
影響因子：11.4
研究團(tuán)隊(duì)：浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院汪小福
原文鏈接：http://www.amp-future.com/vip_doc/28586987.html
轉(zhuǎn)基因作物已在世界各地廣泛種植，許多國家逐步完善轉(zhuǎn)基因監(jiān)管措施以確保轉(zhuǎn)基因作物的安全。開發(fā)快速和準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)基因現(xiàn)場檢測方法對農(nóng)業(yè)和生物安全非常重要，可以減輕公眾對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的擔(dān)心。
在本研究中，課題組開發(fā)了一種新的一鍋法反應(yīng)——雙重MIRA檢測結(jié)合雙重CRISPR（MR-DCA方法），用于同時檢測轉(zhuǎn)基因作物中的CaMV35S和NOS遺傳靶點(diǎn)，為轉(zhuǎn)基因作物的檢測提供了一種簡單高效的方法。
Part 01實(shí)驗(yàn)方法
將雙重MIRA產(chǎn)物用雙Cas13a、Cas12a系統(tǒng)進(jìn)行分析，產(chǎn)生兩個互不干擾的獨(dú)立信號，再通過照明儀器讀取熒光顏色，或通過帶有兩條T線的試紙條，以實(shí)現(xiàn)雙通道讀出。整個過程在不到35min的時間內(nèi)完成，檢測限低至20個拷貝。
（MR-DCA檢測CaMV35S和NOS的原理）
整個實(shí)驗(yàn)分為3個步驟：MIRA擴(kuò)增、CRISPR反應(yīng)、2種方式的結(jié)果判讀。
CaMV35S基因作為Cas13a的靶標(biāo)，NOS基因作為Cas12a的靶標(biāo)，分別設(shè)計(jì)了兩對MIRA引物。Cas13a系統(tǒng)只識別RNA，因此設(shè)計(jì)了正向引物區(qū)域，包含一個T7啟動子，用于后續(xù)轉(zhuǎn)錄，激活Cas13a。為NOS基因增加一個PAM 。以上的這些的添加確保了Cas13a和Cas12a蛋白都可以與各自的crRNA結(jié)合，且兩個系統(tǒng)之間不存在干擾或交叉反應(yīng)。
Part 02實(shí)驗(yàn)情況
靈敏度和特異性
將樣本梯度稀釋來測試MIRA反應(yīng)的熒光強(qiáng)度，發(fā)現(xiàn)樣本濃度在20μL時仍能檢測到熒光強(qiáng)度，最終實(shí)驗(yàn)選定20μL的濃度。
（不同樣本濃度和熒光強(qiáng)度測試）
（不同樣本濃度和試紙條顯色測試并用強(qiáng)度量化計(jì)算）
為了進(jìn)一步評價MR-DCA的特異性，課題組對非轉(zhuǎn)基因動物混合樣品和非轉(zhuǎn)基因植物混合樣品進(jìn)行了檢測。結(jié)果顯示只有含有CaMV35S和NOS的轉(zhuǎn)基因樣品具有較高的熒光信號，而其他樣品的熒光強(qiáng)度與陰性對照比較接近。MR-DCA可作為一種特定的雙靶點(diǎn)核酸檢測平臺。
用MR-DCA對24個作物樣品進(jìn)行了測試。其中1、2、15、16、21、22是含有CaMV35S啟動子的轉(zhuǎn)基因玉米。7、8、23、24是含有NOS終止子的抗病轉(zhuǎn)基因水稻。3、4、11、12、13、14、17、18是含有CaMV35S啟動子和NOS終止子轉(zhuǎn)基因大豆。
（24個樣本的檢測結(jié)果）
反應(yīng)快速
反應(yīng)時間是現(xiàn)場檢測的一個重要因素，課題組觀察到在反應(yīng)時間為10 min時，就已經(jīng)能用熒光儀檢測到FAM和HEX的熒光信號。MIRA結(jié)合CRISPR反應(yīng)，也在15min后觀察到黃色熒光。
（不同MIRA反應(yīng)時間下的熒光信號）
（MIRA反應(yīng)不同時間下的試紙條顯色并用強(qiáng)度量化計(jì)算）
實(shí)驗(yàn)結(jié)論
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該雙重MIRA具有良好的特異性，并能準(zhǔn)確地獲得CaMV35S和NOS的擴(kuò)增產(chǎn)物，Cas13a和Cas12a系統(tǒng)獨(dú)立反應(yīng)，互不干擾。MR-DCA檢測能在35min的低溫下準(zhǔn)確檢測到20個拷貝，具有在田間檢測轉(zhuǎn)基因作物的巨大價值。
相關(guān)產(chǎn)品：
MIRA試劑盒及試紙條系列：
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貨號 |
產(chǎn)品 |
規(guī)格 |
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JY0209 |
雙靶標(biāo)HybriDetect側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l（彩虹型） |
50T |
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JY0201 |
單靶標(biāo)HybriDetect側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l（彩虹型） |
50T |
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JY0307 |
Tiosbio? CRISPR單酶切及擴(kuò)增產(chǎn)物檢測試紙條 |
50T |
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JY0301 |
CRISPR Cas12/13 HybriDetect試紙條 |
50T |
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JY0308 |
Tiosbio? CRISPR雙酶切檢測試紙條（變色龍） |
50T |
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WLB8201KIT |
DNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒（基礎(chǔ)型） |
48T |
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WLE8202KIT |
DNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒（熒光型） |
48T |
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WLN8203KIT |
DNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒（膠體金試紙條型） |
48T |
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WLRB8204KIT |
RNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒（基礎(chǔ)型） |
48T |
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WLRE8205KIT |
RNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒（熒光型） |
48T |
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WLRN8206KIT |
RNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒（膠體金試紙條型） |
48T |
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WLB5001 |
DNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒（液體基礎(chǔ)型） |
100T |
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WLN5002 |
DNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒（液體膠體金型） |
100T |
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WLR5003 |
DNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒（液體熒光型） |
100T |
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WLRB5001 |
RNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒（液體基礎(chǔ)型） |
100T |
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WLRN5002 |
RNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒（液體膠體金型） |
100T |
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WLRE5003 |
RNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒（液體熒光型） |
100T
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Cas酶系列
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貨號 |
包裝規(guī)格 |
中文名稱 |
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32108-01 |
100 pmoL |
LbCas12a (Cpf1) |
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32108-03 |
1,000 pmoL |
LbCas12a (Cpf1) |
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32117-01 |
100 pmoL |
LwaCas13a (C2c2) |
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32117-03 |
1,000 pmoL |
LwaCas13a (C2c2) |
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32118-01 |
100 pmoL |
AapCas12b (C2c1) |
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32118-03 |
1,000 pmoL |
AapCas12b (C2c1) |
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32119-01 |
100 pmoL |
Un1Cas12f1 (Cas14a1) |
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32119-03 |
1,000 pmoL |
Un1Cas12f1 (Cas14a1) |
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32104-01 |
100 pmoL |
AsCas12a (Cpf1) |
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32104-03 |
1,000 pmoL |
AsCas12a (Cpf1) |
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32116-01 |
100 pmoL |
AacCas12b (C2c1) |
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32116-03 |
1,000 pmoL |
AacCas12b (C2c1) |
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32106-01 |
100 pmoL |
FnCas12a (Cpf1) |
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32106-03 |
1,000 pmoL |
FnCas12a (Cpf1) |
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32110-01 |
100 pmoL |
Lb5Cas12a (Cpf1) |
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32110-03 |
1,000 pmoL |
Lb5Cas12a (Cpf1) |
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32101-01 |
100 pmoL |
SpCas9 |
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32101-03 |
1,000 pmoL |
SpCas9 |
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32102-01 |
100 pmoL |
Sp-dCas9 |
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32102-03 |
1,000 pmoL |
Sp-dCas9 |
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32120-01 |
100 pmoL |
Sp-nCas9（H840A） |
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32120-03 |
1,000 pmoL |
Sp-nCas9（H840A） |